2019新型冠状病毒核酸检测的研究状况与应用探讨

冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒^[2-4]。目前除本次在武汉引起病毒性肺炎暴发疫情的2019-nCov外，已知有6种冠状病毒会感染人类并引起疾病，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV。其中，SARS-CoV引起的严重急性呼吸综合征（SARS）及MERS-CoV引起的中东呼吸综合征（MERS）都造成了较大范围的疫情传播及较严重的临床后果。冠状病毒感染症状可从普通感冒到重症肺部感染。从此次武汉不明原因肺炎患者呼吸道分离出的2019-nCoV为一种β属的新型冠状病毒，直径约60~140 nm，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性。目前研究显示其与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上^[5]。体外分离培养约96h时，2019-nCoV即可在人呼吸道上皮细胞内被发现，而在非洲绿猴肾细胞系Vero E6和人肝细胞系Huh-7中分离培养约需6 d。

2019-nCoV侵入人体宿主细胞由细胞膜上受体介导，研究表明其受体与人SARS-CoV同为ACE2受体^[8]。ACE2受体广泛存在于呼吸道、球结膜、口腔、回肠和结肠等部位的上皮细胞，这也决定了冠状病毒的三大感染途径：呼吸、接触、粪口。最新甚至有母婴垂直传播的报道，表明血液中也可能存在病毒。因此，感染者的鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液、血清、粪便等标本均可作为病毒分子生物学检测的样本来源。

目前诊断NCP在分子生物学手段上的常用方法主要有2种，分别为病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。

目前最常用的是实时荧光逆转录PCR法（实时荧光RT-PCR）。实时荧光PCR是一种快速简便、成本较低、且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。2019-nCov属RNA病毒，PCR扩增前需要先进行逆转录反应（RT），商品化试剂盒通常把RT反应液与PCR反应液预混在一起，一步法完成逆转录与扩增检测的整个过程，简便且明显降低逆转录后开盖易导致污染的风险。

目前国家药品监督管理局（NationalMedical Products Administration, NMPA）已批准6家基于实时荧光RT-PCR的2019-nCov核酸检测试剂盒（见表1），1家基于高通量测序的试剂盒。实时荧光RT-PCR试剂盒主要分为2类，二重实时荧光RT-PCR和三重实时荧光RT-PCR（均为Taqman探针法）；二重检测的靶基因主要是RdRp基因和N基因；三重是RdRp基因、N基因和E基因。目前基于2019-nCov基因组序列，已有多个研究^[9]公布了其检测的引物和探针序列，美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）也在其官网上公布了引物和探针序列（https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html），实时荧光RT-PCR扩增的常见区域如图1所示。

宏基因组二代测序法（metagenomics next generation sequencing, mNGS）指的是以宏基因组（metagenomics）为研究对象，直接利用NGS对临床样本中的基因组进行检测，实现病原微生物的快速识别、性能鉴定、功能研究以及微生物间、微生物与环境间相互关系的研究。最近研究报道利用mNGS快速检测新型冠状病毒感染患者肺泡灌洗液样本中的2019-nCoV，并通过进一步进化树分析表明新冠病毒与蝙蝠来源的冠状病毒株bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21核酸相同率大于87.5%^[10]。

与前述实时荧光RT-PCR相比，NGS不但可以鉴定新的病毒株，也可用于早期低病毒含量样本的检测或实时荧光RT-PCR检测可疑或灰区结果的确认；但鉴于目前大多数医院缺乏测序设备、缺乏生信人员来协助测序结果的解读、缺乏研发阶段的流程和试剂配比的优化、缺乏阳性和阴性参考品的设立以及初步预临床试验的支持，再加上NGS的成本高和检测周期较长，目前还不适合于常规临床检测。

3.1 试剂的性能验证

由于此次疫情暴发突然，在试剂盒的开发中来不及用足够的临床样本进行完整的性能确认，而临床需求又迫在眉睫，因此，匆忙上阵的各厂家核酸检测试剂盒质量可能参差不齐，其稳定性和可靠性有待进一步确认。本院及南通市第一人民医院3例临床高度疑似患者的病毒核酸检测阳性结果的样本，送检另一家实验室却显示阴性结果，也一定程度上说明了该问题。为此，实验室除应选择NMPA批准的试剂开展临床检测外，还需在正式使用前进行性能验证，至少包括检出限和灰区的验证，同时还需要在临床检测过程中累积通过室内质控和临床样本检测得到的数据，以及与其他实验室间的结果对比开展进一步的评价和其他性能指标的验证（如精密度、符合性等）。

3.2 标本的质量评估

样本的质量是决定后续病毒核酸检测的重要前提。由于NCP患者在下呼吸道具有更高的病毒载量，所以支气管/肺泡灌洗液的检出率相对更高，但这类标本的获取因可操作性及对人损伤等问题仅限于已上呼吸机的重症患者^[11]；其次是痰，但本次肺炎不像以往的流感，很多病患干咳、无痰；因此，目前最普遍也最简单的采样方式是鼻咽拭子。但是，鼻咽拭子采集方法具有明显的局限性，其受采样材料（拭子和保存液）、采样部位与深度、采样量、采样时机以及采样人员的操作等影响，特别是目前2019-nCov的自身特点和病程转归尚未完全阐明，再加上NCP潜伏期长，绝大多数患者就诊时可能已经迁延了数天至数周，是否是鼻咽拭子检测的最佳时期，样本内病毒载量是否仍然在方法学的检测范围内还有待确定^[12]。建议反复多次、多部位，且由经培训的熟练人员进行规范采样。

3.3 提取效率的评估

目前绝大部分获批的检测试剂盒缺乏内标且对核酸提取的方法及质量未给予明确的说明或要求，再加上模板上样量甚微（仅有体积而无浓度要求），实验室对核酸提取质量或效率的评估至关重要。

实验室应选择简便、高效安全、自动化的核酸RNA提取方法，关注样本类型与提取试剂的配套性，关注提取试剂与核酸检测试剂的匹配性，建议使用配套的提取试剂或厂家推荐的提取试剂，并在性能验证中对临床样本的提取效率和加样量（体积和浓度）进行充分地评估。

3.4 扩增效率的评估

推荐使用含内标的检测试剂，且应与实验室的仪器设备相匹配，并严格按试剂盒说明书设置上机的扩增检测参数和程序。实验室在扩增检测后分析阶段应观察整体及单个扩增曲线的状态，是否呈现光滑而典型的S型，并根据分析后图像进行参数的微调，确定BaseLine（基线）的Start值（可设在3~15）、End值（每批次最先起跳的荧光曲线起跳前1～2循环处）以及Threshold值（阈值，设定原则以阈值线刚好超过阴性质控检测荧光曲线的最高点）。

3.5 室内质控

3.5.1 质控方案 每批次检测设立1份弱阳性质控和3份阴性质控，阴性质控应随机放在临床样本中间，与待测样本同批参与全检测过程。弱阳性质控测定为阳性、3个阴性质控全部为阴性，视为在控；反之，则为失控，不可发出报告，应立即分析原因，必要时重新检测。

3.5.2 质控品 当实验室出现阳性标本后建议自制质控品（以取代试剂盒弱阳性对照），56℃干浴30min灭活处理、低值且包括2个或2个以上靶点；阴性质控为生理盐水/DEPC处理水，建议其中至少1份用于环境污染的评估，即开盖放置在提取仪/操作台面上过夜。

3.6 结果解读和报告的规范

  实验室要确认某病例为阳性，须满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒至少2个靶标（ORF1ab/N/E）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。（1）如一个靶标阳性或检测结果落在灰区的标本需复测且尽可能用另一种试剂复验，仍然可疑则须重新采样（包括不同部位及样本类型）进行检测。（2）阴性结果也不能完全排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量不合格，样本收集得过早或过晚，没有正确地保存、运输和处理样本，方法学窗口期，技术本身存在的原因如病毒变异、PCR抑制等。

报告的规范也至关重要，要以临床医师能够正确理解和应用的方式报告结果，至少涉及以下要素。

（1）报告要及时，需向临床明确检测周转时间（turn-around time, TAT）。

（2）报告内容须完整，包括患者信息，标本信息（种类、唯一编号及其质量），检测信息（靶点、方法、试剂/仪器），采样、接收、检测和报告时间，送检单位/检测实验室及联系方式等。

（3）报告上明确标出“检出限”（不可混用为参考值/参考区间；应根据试剂盒说明书及性能验证结果来确定；不同试剂盒会存在差异，见表1）。

（4）报告方式：不报告为“阴性”、“阳性”。

a. 阴性结果报告为“未检出”或“低于检出限”，同时应备注“未检出”的可能原因：方法学局限性，标本采集时机，标本采集/运输/储存/检测等环节的问题等。

b. 阳性结果报告为“检出”并标出具体靶标。

c. “可疑结果”描述为：1个靶点阳性，或检测结果低于检出限但有扩增反应（在灰区），已复验，建议重新采样检测。

（5）必要时，结合实验室其他指标尤其是血清学免疫指标（如有）进行综合分析，给出相应的解释或建议。